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Characterization and antibacterial activity of alkaloids and polyphenols extracts from Haplophyllum tuberculatum (Forssk.) A. Juss.
(Pamukkale University, 2023) Djouahra-Fahem, Djamila; Bensmail, Souhila; Bouteldja, Razika; Messad, Sara; Ferhoum, Fatiha; Bourfis, Nassima; Acheuk, Fatma; Fazouane, Fethia
Haplophyllum tuberculatum is a medicinal plant belonging to the Rutaceae family, is renowned for its various therapeutic properties. This study aims to characterize the alkaloids and polyphenol extracts from this plant and assess their antibacterial activity. Herein, the extraction of polyphenols and alkaloids from this plant was performed by the maceration method. Folin Ciacalteu's method was used to estimate the total phenolic content, and the qualitative characterization of the two extracts was performed by thin-layer chromatography. Whilst, the antibacterial activity of the two extracts was tested with the disk diffusion method on a solid medium and the minimal inhibitory concentration (MIC) of susceptible bacteria was determined using the agar dilution method. Our results indicate respective yields of 8.39% in polyphenols and 0.37% in alkaloid extracts, while the total phenolic content was estimated to be 74.45 mg GAE/g of dry matter in polyphenolic extract. Thin-layer chromatography analysis allowed choosing the system toluene-acetate-ethanol-concentrated ammonia (40:4:8:3, v/v) to separate H. tuberculatum alkaloids, and ethyl acetate-methanol-water (100:13.5:10, v/v/) for the separation of its polyphenols. The same analysis detected traces of quercitin, catechin, and rutin in the polyphenolic extract. Our findings demonstrated good antibacterial activity on Gram-positive strains such as Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Bacillus subtilis ATCC 6633, and moderate activity on Pseudomonas aeruginosa ATCC 27953, with MICs ranging from 0.625 to 10 mg/mL for alkaloids and from 5 to 20 mg/mL for polyphenols.
Factors affecting acid protease production by Mucor circinelloides MG603064.1 through SmF process: characterization and fromage frais making
(BioTechnologia, 2023) Bensmail, Souhila; Boudjema, Khaled; Naimi-Fazouane, Fethia; Bensmail, Samira; Djouahra-Fahem, Djamila; Ferhoum, Fatiha; Bourfis, Nassima
The exploitation of food industry wastes and their conversion into value-added products present a promising and continuously growing field, given the diversity of elaborated wastes. The current work aimed to utilize sweet cheese whey as a growth medium for acid protease production by a local fungus strain. The biochemical and physicochemical properties of the cheese whey, such as pH, conductivity, chemical oxygen demand, biological oxygen demand (BOD5), total nitrogen and protein contents, and mineral salts, were assessed using various analytical methods. The effect of certain parameters on acid protease production by Mucor circinelloides MG603064.1 through the SmF process was investigated using the conventional design method "One factor at a time". Subsequent to characterization, the crude extract was used in a trial to create fromage frais, compared to the commercial rennin CHY-MAX® Powder Extra. Cheese whey characterization revealed its richness in total nitrogen (1.044 ± 0.044 g/l), protein content (6.52 ± 0.04 g/l), and principal mineral salts: calcium (1.637 ± 0.037 g/l), phosphorus (1.173 ± 0.023 g/l), and chloride (1.66 ± 0.09 g/l). The optimal values of the SmF process for acid protease production, such as the inoculum size, beef extract, and KH2PO4 supplements, the initial pH of cheese whey, and incubation temperature were, respectively, 11% (v/v), 0.4% (w/v), 0.5% (w/v), 5.5, and 30°C. Under these conditions, the lowest milk-clotting time of 290 s was achieved, representing an 18.41-fold increase compared to the initial step using the unoptimized medium. The enzyme showed maximum milk-clotting activity at pH 5, a temperature of 60°C, and in the presence of 0.025 M of CaCl2. The enzyme activity also significantly improved with sonication (35 kHz) for 10 min. The crude extract of M. circinelloides ensured the production of fresh cheese samples with characteristics roughly similar to those obtained by the control (CHY-MAX® rennin). The acid protease of M. circinelloides could successfully substitute the conventional rennin in the manufacture of fresh cheese.
Optimisation de la production de la protéase acide par aspergillus niger sur milieu solide : purification et caractérisation
(2012) Bensmail, Souhila
La pénurie mondiale en présure à susciter le développement de la recherche des nouveaux succédanés capables de coaguler le lait, tout en assurant de bons rendements fromagers. Dans cet objectif, la production de la protéase acide extracellulaire par l’espèce fongique Aspergillus niger isolée localement, sur un résidu agroalimentaire peu couteux fermenté par des cultures solides (SSF), a été optimisée de façon à obtenir la meilleure activité coagulante. Un essai de purification et une caractérisation biochimique de l’enzyme ont été également effectués. Les résultats obtenus montrent que la meilleure production de cette enzyme (830 US/g avec un rapport AC/AP de 4,25) a été obtenue sur milieu à base de son de blé (10g), humidifié à un taux de 39,21% par une solution minérale Czapek-Dox à pH 4, incubé à 30°C pendant 72 heures et inoculé par la suspension fongique de 106 spores/ml. L’application du plan factoriel fractionnaire à l’optimisation de la production de la protéase acide d’A. niger, a permis de déterminer l’influence significative du taux d’humidité du substrat et de la quantité en CaCl2 dans le milieu (deux effets contradictoires positif et négatif respectivement) et d’exclure l’importance des autres facteurs du plan d’expérience (la quantité du lait écrémé et celle de la caséine). Une activité coagulante de 582 US/g et un rapport AC/AP de 4,32 ont été obtenus pendant cette étude. La protéase extracellulaire a été purifiée 8 fois avec un rendement d’environ 10%, en utilisant la précipitation au (NH4)2SO4 à 80% de saturation et la chromatographie échangeuse d'ions sur DEAE-A50. La purification était plus efficace dans ces conditions par rapport à l'utilisation de la chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephadex-G100 comme l’étape qui suive la précipitation. L'enzyme a été trouvée sous une forme monomérique, ayant un poids moléculaire de 47,7kDa par SDS-PAGE, résultats confirmés par la zymographie. Les conditions optimales de l’activité coagulante de l’extrait enzymatique partiellement purifié ont été déterminées ; elles correspondent aux paramètres suivants: température de 45°C, pH 5 (protéase acide) et une concentration en CaCl2 de 0,04M. Il présente une stabilité dans la gamme du pH 3,0-5,0 à 4°C pendant 24 heures dans le tampon citrate de sodium (0,1M) et une stabilité thermique jusqu’à 45°C pendant 1 heure
Optimisation de la production de protéases par une souche fongique locale (Rhizopus, Mucor) : purification, caractérisation et aptitude à la fabrication fromagère
(2020) Bensmail, Souhila
Les protéases aspartiques produites par différentes moisissures non pathogènes, appartenant à l'ordre Mucorales, sont couramment utilisées dans l'industrie laitière en tant qu'agents coagulant le lait. L'objectif de notre travail cible la recherche des nouvelles souches fongiques locales produisant des protéases coagulant le lait afin d'être appliquées dans la fabrication du fromage. La plupart des souches isolées à partir des sols agricoles (centre d'Algérie) ont été capables de produire des extraits enzymatiques avec des temps de coagulation entre 2 et 17 min. La souche la plus performante, identifiée comme étant Mucor circinelloides (von Thieghem) MG603064, a été sélectionnée pour optimiser la production par fermentation sur milieu solide, via la méthode classique "un seul facteur à la fois". L'activité coagulante maximale de 571,43 US/mL a été obtenue en utilisant 10 g du son de blé comme la source principale de carbone, contenant 1% (p/p) de galactose, humidifié avec la solution minérale M-9 (pH 6,0) et incubé à 30°C pendant 96 h.Le plan Plackett?Burman à deux niveaux a été appliqué afin de sélectionner les facteurs améliorant de manière significative la production de la protéase coagulante. Le milieu de production a été préparé sur la base des résultats préliminaires. L'analyse statistique de la réponse (activité coagulante) a révélé que les facteurs contributifs sont: la température de fermentation, le pH de milieu, le temps d'incubation et le niveau d'humidité. Les autres facteurs testés (taille d'inoculum, (NH4)2SO4, galactose) ont été exclus de l'étude. Le plan a montré qu'un milieu contenant 0,1 g de (NH4)2SO4, humidifié à un taux de 50,1%, inoculé avec 1 mL de la suspension de spores (12,6×107 spores/mL) et incubé à 25°C pendant 96 h, était optimal pour la production de la protéase avec une activité coagulante de 888,9 US/mL. Une augmentation de la production par un facteur de 1,69 a été notée suite à l'application du plan composite centré pour atteindre un maximum de 1500 US/mL, obtenu par fermentation à 25°C avec un taux d'humidité de 56,1% et un pH de 4,23 mais après 72 h d'incubation. La purification de l'enzyme, par fractionnement au (NH4)2SO4 solide à 20?70% de saturation suivie d'une chromatographie d'exclusion moléculaire sur Sephadex G-100, a permis d'obtenir une protéase purifiée 20 fois avec un rendement de 18,41%. L'activité optimale de la protéase purifiée a été obtenue à pH 5, une température de 60°C et en présence de CaCl2 à 25 mM. La protéase est stable dans l'intervalle de pH 3?4,5 pendant 24 h à 4°C dans le tampon citrate (0,1 M) et conserve plus de 80% de son activité maximale à 45°C pendant 1 h, avec une inactivation complète à 70?75°C. L'inhibition de l'activité coagulante obtenue en présence de 0,1 mM de Pepstatine A (98,6%) confirme que l'enzyme est une protéase à acide aspartique. L'activité coagulante a été significativement améliorée par 40,5 ; 59,5 ; 75,6 et 85% en présence des ions Mg2+, Fe2+, Mn2+ et Zn2+, respectivement, et fortement inhibée par Al3+ (93,1%) et Hg2+ (94,4%) à une concentration de 10 mM. La stimulation maximale d'activité de 120% a été révélée en présence de Ba2+ en utilisant la même concentration. Les extraits bruts et pré-purifiés ont été appliqués dans des essais de fabrication de fromages à pâte molle type Camembert et semi-dure type Edam, en tant que des substituants possibles pour la présure animale par comparaison à deux coagulants commerciaux. Les propriétés physicochimiques des fromages produits étaient très proches. Une faible qualité sensorielle des fromages a été obtenue avec l'extrait brut, dans les deux cas de fabrication, qui a été améliorée avec l'utilisation de la protéase pré-purifiée pour atteindre celle donnée par la présure commerciale dans le cas du fromage Camembert. Les résultats obtenus durant les essais de fabrication du fromage sont très satisfaisants, ce qui permet de prédire que le coagulant purifié de M. circinelloides peut être considéré comme un nouveau succédané de la chymosine bovine. Afin d'atteindre cet objectif, la présente étude doit être complétée par des étapes d'optimisation et de purification supplémentaires pour augmenter l'activité enzymatique de la protéase pure et son application dans la production de différentes variétés du fromage
Production of Extracellular Rennin-Like Enzyme by a Newly Isolate Mucor circinelloides (von Tieghem) and its Application in Camembert Cheese Making
(Baqiyatallah University of Medical Sciences, 2020) Bensmail, Souhila; Boudjema, Khaled; Naimi-Fazouane, Fethia
Introduction: Aspartic proteases produced by different non-pathogenic fungi belonging to mucorales, are commonly used as milk-coagulants. The present study aims to optimize conditions for milk-clotting protease production by a new strain of Mucor genus and to assess its ability in soft cheese making. Materials and Methods: About 20 fungal strains isolated from soil were investigated for their potential to produce milk-clotting proteases for further applications in cheese making. The hyper producer strain Mucor circinelloides 2095-2047 was selected for optimization of rennin-like enzyme production under solid-state fermentation (SSF) using the stepwise modifications of the selected parameters. The enzyme produced under the optimal conditions was partially purified and then applied in Camembert cheese making trials compared to the crude extract and commercial rennet. Results: The maximum milk-curdling activity achieved after optimization (571.43 SU/mL) was obtained using wheat bran (10 g) as the mainly source of carbon containing 1% galactose; moistened with the M-9 solution (pH 6.0) and incubated at 30°C for 96 hours. The enzyme of M. circinelloides was partially purified with a high recovery of 105% and 6.23-fold purity after (NH4)2SO4 fractionation and dialysis. The physicochemical properties of the three produced cheeses were very close. A low sensory quality of cheese was obtained with the crude extract which was getting better using the pre-purified enzyme. This extract was able to develop a very close or even a similar sensory quality to that obtained by the commercial rennet. Conclusions: According to findings, it is possible to propose the purified enzyme of M. circinelloides as a new alternative for rennet, but further optimization, purification and cheese production tests are required. © 2020 The Author(s)
Trichoderma spp. isolates from the rhizosphere of healthy olive trees in northern Algeria and their biocontrol potentials against the olive wilt pathogen, Verticillium dahliae
(Springer, 2021) Reghmit, Abdenaceur; Benzina‑tihar, Farida; López Escudero, Francisco Javier; Halouane‑Sahir, Fatma; Oukali, Zahia; Bensmail, Souhila; Ghozali, Nourelhouda
Trichoderma species are known for their ability to control many plant diseases. In this study, fifteen (T1–T15) indigenous strains of Trichoderma spp. isolated from rhizosphere soils of olive in northern Algeria were investigated for their biocontrol potential against eleven strains of Verticillium dahliae, the causal agent of wilting on olive (Olea europea cv. europea L.). Direct and indirect confrontation assays were performed to investigate if isolates of Trichoderma affect mycelium growth. In addition, gas chromatography–mass spectroscopy (GC–MS) was applied to identify the volatile organic compounds (VOCS) produced by the T2 isolate. Besides, Trichoderma isolates were screened for the production of extracellular enzymes on solid medium including chitinases, proteasesand cellulases. Results showed that Trichoderma isolates demonstrated an effective potential in reducing mycelium growth against V. dahliae in vitro. T12 was the highest antagonistic of the Trichoderma isolates by direct confrontation assay method. This isolate exhibited an average inhibition rate of 68.86% against V. dahliae isolates, whereas the evaluation of volatile metabolites effect revealed that inhibition percentage of radial growth varies between 55.26 and 65.93%. Importantly, results showed the presence of 33 compounds detected in the methanolic and hexanic fraction of T2 isolate, including important volatile compounds with antifungal activities such as Undecane, Octadecane, Eicosane, 13-Docosenamide, (Z), Hexadecanamide, 9-Octadecenamide, (Z), Cyclopentanone, 2-methyl, Tetradecanoic acid, propyl ester, Tetradecanoic acid, oleic acid, and n-Hexadecanoic acid. Interestingly, all isolates tested showed chitinolytic, proteolytic and cellulolytic activity. T2 and T12 were the effective Trichoderma isolates showing high chitinase production on solid medium. Besides that, isolates T2 and T6 demonstrated the highest chitinolytic and proteolytic activity with values 0.043 µmol/ml/min and 0.019 µmol/ml/min, respectively. Overall, the isolates, T2, T6, and T12 are the most effective agents against olive wilt pathogen V. dahliae in vitro. Hence, they could be further investigated for biocontrol of olive wilt in vivo