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Item Optimisation de la production de la protéase de Rhizopus stolonifer sur milieu solide : purification et caractérisation(2011) Gais, SoumeyyaLe but de cette présente investigation est la production, la purification et l’étude de certaines propriétés de la protéase de Rhizopus stolonifer en vue de son utilisation dans la coagulation du lait. L’étude de l’influence de certains paramètres sur le taux de production de la protéase a été réalisée. Il a été constaté que la température optimale de production de la protéase de Rhizopus stolonifer est de 28 °C, son pH optimum est de 6, la taille optimale de l’inoculum est de 2 x 106 spores /ml, le taux d’humidité optimal du son de blé est de 50.6%, la quantité du son de blé optimale est de 10 g et le temps d’incubation optimale est de 96 heures. L’addition de certaines sources de carbone et d’azote au son de blé pour l’amélioration de l’activité coagulante de notre protéase, nous a permis de noter que la meilleure source de carbone et d’azote sont le galactose { 10% et la peptone { 1% respectivement. La purification de la protéase par précipitation au sulfate d‘ammonium à 80% suivie d’une chromatographie par filtration sur gel sephadex G100 a permis de déceler un rendement en activité de la protéase de 9.25%, un facteur de purification de 19.2 avec une activité spécifique de 2850,7 U/mg et un poids moléculaire de 41.4 ± 1.00 kDa. La vérification de l’homogénéité de la protéase de R. stolonifer par électrophorèse en conditions dénaturante a révélée un poids moléculaire de 42.96 ± 1.00 kDa. La caractérisation de la protéase de R. stolonifer a révélé que sa température optimale d’activité coagulante est de 50°C et que sa stabilité est notée aux températures 30 à 45°C. Son pH optimum est de 5.5 et que l’extrait purifié est stable pendant 24 h { 4 °C dans le tampon citrate phosphate. L’étude de l’effet de la concentration en extrait purifié et en chlorure de calcium sur l’activité coagulante de la protéase de R. stolonifer montre que l’augmentation de son activité coagulante est proportionnelle à leurs concentrations respectives. L’extrait purifié de R. stolonifer préserve mieux son activité coagulante au cours de la conservation par congélation à -18°C comparativement à la réfrigération à 4°C. L’inhibition de l’activité coagulante de l’extrait purifié par la pepstatin A à 71%, nous oriente vers la possibilité de la présence d’un groupement aspartyl dans le site actif de la protéase de R. stoloniferItem Optimisation de la production de la protéase acide par aspergillus niger sur milieu solide : purification et caractérisation(2012) Bensmail, SouhilaLa pénurie mondiale en présure à susciter le développement de la recherche des nouveaux succédanés capables de coaguler le lait, tout en assurant de bons rendements fromagers. Dans cet objectif, la production de la protéase acide extracellulaire par l’espèce fongique Aspergillus niger isolée localement, sur un résidu agroalimentaire peu couteux fermenté par des cultures solides (SSF), a été optimisée de façon à obtenir la meilleure activité coagulante. Un essai de purification et une caractérisation biochimique de l’enzyme ont été également effectués. Les résultats obtenus montrent que la meilleure production de cette enzyme (830 US/g avec un rapport AC/AP de 4,25) a été obtenue sur milieu à base de son de blé (10g), humidifié à un taux de 39,21% par une solution minérale Czapek-Dox à pH 4, incubé à 30°C pendant 72 heures et inoculé par la suspension fongique de 106 spores/ml. L’application du plan factoriel fractionnaire à l’optimisation de la production de la protéase acide d’A. niger, a permis de déterminer l’influence significative du taux d’humidité du substrat et de la quantité en CaCl2 dans le milieu (deux effets contradictoires positif et négatif respectivement) et d’exclure l’importance des autres facteurs du plan d’expérience (la quantité du lait écrémé et celle de la caséine). Une activité coagulante de 582 US/g et un rapport AC/AP de 4,32 ont été obtenus pendant cette étude. La protéase extracellulaire a été purifiée 8 fois avec un rendement d’environ 10%, en utilisant la précipitation au (NH4)2SO4 à 80% de saturation et la chromatographie échangeuse d'ions sur DEAE-A50. La purification était plus efficace dans ces conditions par rapport à l'utilisation de la chromatographie d'exclusion moléculaire sur gel de Sephadex-G100 comme l’étape qui suive la précipitation. L'enzyme a été trouvée sous une forme monomérique, ayant un poids moléculaire de 47,7kDa par SDS-PAGE, résultats confirmés par la zymographie. Les conditions optimales de l’activité coagulante de l’extrait enzymatique partiellement purifié ont été déterminées ; elles correspondent aux paramètres suivants: température de 45°C, pH 5 (protéase acide) et une concentration en CaCl2 de 0,04M. Il présente une stabilité dans la gamme du pH 3,0-5,0 à 4°C pendant 24 heures dans le tampon citrate de sodium (0,1M) et une stabilité thermique jusqu’à 45°C pendant 1 heure